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在由于细胞浆/肌浆网钙穿梭异常导致的心脏疾病治疗中,但最新研究发现新生小鼠的心脏具有短暂的再生潜能

2014年5月7日,国际学术期刊《Molecular and Cellular
Biology》杂志发表了南京大学模式动物研究所杨中州课题组与鼓楼医院胡娅莉及江苏省人民医院李新立课题组的合作研究成果“Phosphoinositide-Dependent
Kinase 1 and mTORC2 Synergistically Maintain Postnatal Heart Growth and
Heart Function in
Mice”。该论文主要阐述了蛋白激酶Akt第473位丝氨酸磷酸化在出生后心肌生长和功能中的作用,发现去除Akt第473位丝氨酸磷酸化加重心肌细胞剔除PDK1小鼠的心肌生长缺陷和心衰,而增加Akt第473位丝氨酸磷酸化则可以挽救心肌细胞剔除PDK1小鼠的心肌生长缺陷和心衰,小鼠可以正常存活。该研究有助于理解人类扩张性心肌病的发生和治疗,提示通过药物抑制PTEN或激活mTORC2复合物可能可以改善扩张性心肌病的状况,提出了新的药物靶点,可以进行药物开发。

心脏搏动过程中,心肌细胞中钙离子在细胞浆与肌浆网之间穿梭是实现心肌兴奋-收缩耦联的关键步骤,这一过程发生紊乱会导致包括心衰在内的诸多心脏疾病。因此,在由于细胞浆/肌浆网钙穿梭异常导致的心脏疾病治疗中,恢复心肌细胞的钙稳态是一种非常诱人的药物研发策略。心肌细胞中,SERCA2a是一个位于肌浆网上的钙-ATP酶,其主要功能是通过水解ATP介导钙离子从细胞浆到肌浆网内的转运,从而控制心肌舒张。在成熟的小鼠心肌细胞中,大约95%的胞浆钙离子是由SERCA2a重新回收到肌浆网内的。SERCA2a表达量或活性降低都延迟会肌浆网对钙离子的重回收,进而导致肌肉舒张/收缩减弱。因此,以SERCA2a为分子靶点恢复心肌细胞钙稳态、进而治疗心衰等心脏疾病具有非常大的前景。然而,SERCA2a功能调控机制到目前为止尚不十分清楚,而此类调控机制的解析有助于为以SERCA2a为靶点进行药物研发提供新思路。

揭示哺乳动物心脏再生调控机制

南京大学博士研究生招霞,卢双双和聂俊伟利用一系列条件性基因剔除小鼠,在出生后心肌细胞中将PDK1,Rictor,PTEN及Akt1剔除,制作了单基因,双基因及三基因剔除小鼠,阐述了它们之间的相互调控机制以及对出生后心肌细胞生长和功能发挥的调控作用。该论文的通讯作者为南京大学模式动物研究所杨中州教授。

2018年12 月19日,模式动物研究所陈帅教授课题组在国际主流期刊《Circulation
Research》上在线发表题为“SPEG Controls Calcium Re-uptake Into The
Sarcoplasmic Reticulum Through Regulating SERCA2a By Its Second
Kinase-Domain
”的论文。该研究从蛋白质组学入手,发现SERCA2a可以与横纹肌特异性表达的蛋白激酶相互作用;通过一系列深入研究证明了SPEG是SERCA2a的一个全新调控因子,可调控钙离子在细胞浆与肌浆网之间的穿梭。这项研究揭示了心脏钙稳态调控的一种新机制,为钙稳态异常导致的心脏疾病的发病机理及治疗提供了新思路。

中科院上海生科院营养科学研究所周斌课题组发现,转录因子GATA4可通过调节一个在心脏中特异表达的分泌型因子FGF16,来维持心脏的修复能力,并对损伤后引起的心肌肥厚起到一定抑制作用。这项工作为心肌损伤修复和病理性心肌肥大的临床治疗提供了理论基础。相关研究论文已在线发表于《发育学》杂志。

该论文被编辑选为当期杂志的亮点文章(Spotlight)进行重点介绍,研究结果之一的心脏切片被选为当期杂志的封面。

SPEG属于肌球蛋白轻链激酶亚组钙调蛋白激酶丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的一员。其C端含有两个串联的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域,其第一个激酶结构域与MLCK亚组的其他成员具有更高的同源性。之前有研究表明,SPEG不仅是心脏发育所必需的、也是维持成年小鼠心脏功能所必不可少的;但是到目前为止仍然不清楚SPEG是如何来调控心脏功能的。

哺乳动物的心脏一直以来被认为是终末分化的器官,不具有再生能力。但最新研究发现新生小鼠的心脏具有短暂的再生潜能,然而这种再生能力在出生一周后就消失了。阐明这个短暂再生过程中的分子调控机制,重新激活心脏修复相关基因的表达,对心肌损伤后心衰的预防有非常重要的意义。

此项研究获得国家科技部和团队自然科学基金委经费资助。

在本篇研究中,陈帅教授课题组首先通过蛋白质组学分析鉴定出SERCA2a是潜在的可以与SPEG发生相互作用的蛋白。研究人员利用免疫共沉降实验证明无论在体内还是体外,SPEG与SERCA2a都存在相互作用。随后通过在细胞系以及新生大鼠原代心室心肌细胞中进行一系列的实验,他们发现SPEG的第二个激酶结构域可以与SERCA2a相互作用、并直接磷酸化SERCA2a的Thr484位点,进而促进SERCA2a的寡聚化,最终增强SERCA2a转运钙离子的能力。

研究人员利用诱导性基因敲除技术,定时定点敲除新生小鼠心肌细胞中的GATA4基因,其心脏就丧失了再生能力。进一步研究发现旁分泌因子FGF16的表达水平在GATA4敲除后也随之降低,并在分子水平上证明了Fgf16是GATA4的一个下游调控基因。研究人员还发现,在心脏损伤后,FGF16可以维持心肌细胞的增殖能力,并对心肌肥大有一定的抑制作用。表明FGF16是心脏特有的且必不可少的保护因子,维持着心脏正常功能和再生潜能。

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图一 SPEG-SERCA2a轴线调控心肌细胞钙离子稳态与心功能

小干扰RNA是一种常见的基因沉默工具,进入细胞后可以引发相应基因的信使RNA快速降解。利用siRNA在NRVC敲降SPEG后,SERCA2a-Thr484的磷酸化水平及肌浆网的钙离子回流都受到了抑制,说明SPEG可以调控SERCA2a的功能。此外,将SERCA2a的Thr484位点突变成不能磷酸化的丙氨酸后,相较于野生型SERCA2a而言,
过表达SERCA2aThr484Ala突变蛋白的NRVC中肌浆网钙离子回流时间延长,进一步说明该磷酸化位点是SERCA2a的关键活性调控位点。

为进一步研究SPEG-SERCA2a这一轴线的在体功能,陈帅教授课题组利用Cre-loxp系统在成年小鼠心脏中特异性敲除Speg基因。与对照小鼠相比,SPEG心脏特异性敲除小鼠罹患严重的扩张型心肌炎,心功能显著降低、并随时间推移不断恶化,最终过早死亡。他们的机制研究显示,缺失SPEG的小鼠心脏中SERCA2a-Thr484的磷酸化水平以及寡聚化都显著降低;最为重要的是,在SPEG心脏特异性敲除小鼠的心功能发生异常之前,其心肌细胞中肌浆网的钙离子回流已经受到抑制。这些结果表明,SPEG-SERCA2a调控轴线具有重要的在体功能,SERCA2a功能受损是SPEG心脏特异性敲除小鼠发生心衰的重要原因。

综上,该项研究发现了心肌细胞中SERCA2a功能调控的全新机制,并且阐明了SPEG是恢复心肌细胞钙稳态以及心衰等心脏疾病治疗的新的分子靶标。

模式动物研究所博士生全超和李敏为本文共同第一作者,南京大学陈帅教授为本文通讯作者。

(模式动物研究所 科学技术处)

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